摘要：菊花轉基因研究這一前沿領域。闡述了菊花在觀賞植物領域的重要地位以及轉基因技術應用于菊花改良的意義。詳細描述了從菊花材料準備、基因選擇與構建到轉基因具體實驗操作的全過程，包括農桿菌介導轉化、基因槍轉化等方法，并對轉基因菊花的篩選、鑒定技術進行了討論。通過對轉基因菊花的表型分析和潛在應用前景的展望，為菊花遺傳改良和相關領域研究提供了全面而深入的理論與實踐參考。

一、引言

菊花（Chrysanthemum morifolium）作為世界著名的觀賞花卉之一，以其豐富的花色、花型和更好的觀賞價值而備受喜愛。在花卉產業中，菊花占據著重要地位。然而，傳統的菊花育種方法在某些性狀改良方面存在局限性，如對病蟲害的抗性、花色和花期的精準調控等。隨著現代生物技術的飛速發展，轉基因技術為菊花的遺傳改良帶來了新的契機。通過將外源基因導入菊花基因組，可以賦予菊花新的優良性狀，突破傳統育種的瓶頸，同時也為研究菊花的生長發育機制提供了有力工具。在自然與科技的交融點上，菊花轉基因研究開啟了一段充滿挑戰與機遇的旅程。

二、材料與方法

（一）植物材料

選擇健康、生長旺盛的菊花品種作為實驗材料。一般選取幼嫩的葉片、莖段或花瓣作為外植體來源。這些外植體在取材后需迅速進行預處理，以保持其細胞活性和降低污染風險。例如，將外植體用流水沖洗 15 - 30 分鐘，然后在無菌條件下用 70% - 75% 的乙醇浸泡 30 - 60 秒，再用含有適量表面活性劑的消毒劑（如 0.1% - 0.2% 的氯化溶液）浸泡 5 - 10 分鐘，最后用無菌水沖洗 3 - 5 次。

（二）基因選擇與構建

目的基因確定

根據期望賦予菊花的性狀來選擇目的基因。例如，如果要提高菊花對病蟲害的抗性，可以選擇來自其他抗蟲抗病植物的相關基因，如蘇云金芽孢桿菌（Bt）毒蛋白基因用于抗蟲，或一些病程相關蛋白基因用于抗病。對于花色改良，可選擇參與花色合成途徑的關鍵基因，如查爾酮合酶（CHS）、類黃酮 3',5'- 羥基化酶（F3'5'H）等。花期調控方面，則可以選擇與開花時間相關的基因，如 CONSTANS（CO）基因及其同源基因。

載體構建

將目的基因克隆到合適的植物表達載體上。常用的植物表達載體有 pBI121、pCAMBIA 系列等。在構建過程中，需要考慮啟動子的選擇。例如，使用花椰菜 mosaic 病毒（CaMV）35S 啟動子可以實現基因在菊花中的高效表達。同時，為了便于篩選轉基因植株，通常會在載體上同時構建標記基因，如抗生素抗性基因（如卡那霉素抗性基因 nptII）或報告基因（如綠色熒光蛋白基因 GFP）。通過限制性內切酶酶切和連接反應等分子生物學技術，將目的基因與載體正確連接，形成重組表達載體。

（三）轉基因方法

農桿菌介導轉化法

農桿菌菌株選擇與培養

選擇具有高效轉化能力的農桿菌菌株，如 LBA4404、GV3101 等。將含有重組表達載體的農桿菌接種于含有相應抗生素的液體培養基（如 LB 培養基）中，在 28℃、200 - 250rpm 的條件下振蕩培養至對數生長期（OD600 = 0.6 - 0.8）。

共培養

將預處理后的菊花外植體浸泡在活化好的農桿菌菌液中 10 - 30 分鐘，然后用無菌濾紙吸干多余菌液。將外植體轉移到共培養培養基上，共培養培養基一般為添加了適量乙酰丁香酮（AS）的 MS 基本培養基。共培養條件為黑暗、22 - 25℃，培養 2 - 3 天。在此過程中，農桿菌將重組表達載體上的 T - DNA 轉移到菊花細胞基因組中。

脫菌與篩選培養

共培養結束后，將外植體轉移到含有抗生素（如頭孢噻肟鈉）的脫菌培養基中，以去除農桿菌。經過多次（一般 2 - 3 次）更換脫菌培養基，確保農桿菌被完整清除。然后，將外植體轉移到含有篩選抗生素（如卡那霉素）的篩選培養基上進行培養。在篩選培養基上，只有成功轉入目的基因（同時含有抗性基因）的細胞才能正常生長和分化。經過數周的培養，可觀察到抗性愈傷組織或芽的形成。

基因槍轉化法

微彈制備

將重組表達載體 DNA 與金粉或鎢粉混合。一般將 1 - 2μg 的 DNA 與 50 - 60mg 的金屬微粒在含有一定濃度 CaCl?和亞精胺的溶液中混合，使 DNA 吸附在金屬微粒表面。通過離心、洗滌等操作獲得均勻的微彈懸浮液。

基因槍轟擊

將菊花外植體放置在基因槍的靶盤上，調節基因槍的參數，如氦氣壓力、轟擊距離等。一般氦氣壓力設置為 7.5 - 1300psi，轟擊距離為 6 - 9cm。利用高壓氦氣將微彈加速并轟擊到外植體表面，使微彈攜帶的 DNA 進入菊花細胞。轟擊后的外植體轉移到合適的恢復培養基中，在黑暗條件下培養 1 - 2 天，然后轉移到正常的篩選培養基上進行后續培養和篩選。

（四）轉基因菊花的篩選與鑒定

篩選方法

基于標記基因的篩選

在篩選培養基上，利用標記基因賦予的抗性或可見表型進行初步篩選。如對于含有卡那霉素抗性基因的轉基因植株，在含有卡那霉素的培養基上，非轉基因植株會因無法抵抗抗生素而死亡，而轉基因植株則能夠正常生長。對于攜帶報告基因（如 GFP）的植株，可以通過熒光顯微鏡直接觀察到綠色熒光，從而快速識別轉基因細胞或植株。

分子生物學鑒定

采用聚合酶鏈反應（PCR）技術，利用針對目的基因和標記基因的特異性引物，對疑似轉基因植株的基因組 DNA 進行擴增。如果能夠擴增出預期大小的條帶，則初步表明目的基因已經整合到菊花基因組中。進一步通過 Southern blotting 技術，可以確定目的基因在菊花基因組中的拷貝數和整合情況。

表型鑒定

根據目的基因的功能，對轉基因菊花進行表型分析。對于抗蟲基因導入的植株，通過人工接種害蟲或在自然蟲源環境下觀察植株受蟲害的情況。對于花色改良基因導入的植株，觀察花朵顏色的變化，并通過高效液相色譜（HPLC）等技術分析花色相關色素的含量和種類變化。對于花期調控基因導入的植株，記錄植株的開花時間，并與野生型菊花進行對比分析。

三、結果

通過農桿菌介導轉化或基因槍轉化等方法，并經過嚴格的篩選和鑒定，成功獲得了轉基因菊花植株。在抗蟲轉基因菊花實驗中，接種害蟲后發現，與野生型菊花相比，轉基因植株受到的蟲害明顯減輕，葉片和花朵的受損程度顯著降低，表明抗蟲基因在菊花中得到了有效表達并發揮了作用。在花色改良方面，導入特定花色基因的菊花植株呈現出了預期的花色變化，如原本白色的菊花品種在導入 F3'5'H 基因后，花朵顏色變為藍色或紫色，HPLC 分析結果也顯示相應花色色素含量增加。花期調控轉基因菊花的開花時間出現了提前或延遲的現象，與野生型菊花相比差異明顯，證明導入的花期調控基因對菊花的開花過程產生了影響。

四、討論

（一）轉基因方法的優化

在菊花轉基因過程中，農桿菌介導轉化法和基因槍轉化法各有優缺點。農桿菌介導轉化法操作相對簡單，成本較低，但對某些菊花品種的轉化效率可能不高，且易受農桿菌菌株和外植體類型的影響。基因槍轉化法不受宿主范圍限制，可用于不同基因型的菊花，但設備昂貴，操作復雜，且可能會對細胞造成較大損傷。因此，需要進一步優化這兩種方法，如通過改進農桿菌侵染條件、選擇更合適的外植體和載體，以及優化基因槍轟擊參數等，來提高轉基因效率和降低對植株的不良影響。

（二）基因表達的穩定性與調控

雖然在轉基因菊花中觀察到了目的基因的表達和相應的表型變化，但基因表達的穩定性是一個需要關注的問題。在長期的生長過程中，可能會出現基因沉默或表達水平變化的情況。這可能與轉基因的整合位點、甲基化修飾等因素有關。因此，需要深入研究基因表達的調控機制，探索如何確保目的基因在菊花整個生命周期中穩定、高效地表達。

（三）轉基因菊花的安全性與環境影響

隨著轉基因技術的應用，轉基因菊花的安全性和對環境的潛在影響也備受關注。在釋放轉基因菊花到自然環境之前，需要全面評估其對生態平衡的影響，如是否會對本地昆蟲、微生物等生物群落產生負面影響，以及轉基因是否會通過花粉傳播等途徑擴散到野生菊花種群中。同時，對于作為觀賞花卉的轉基因菊花，還需要考慮其對人類健康的潛在風險，如是否會引起過敏反應等。

五、結論

菊花轉基因研究在探索自然與科技的交匯中取得了顯著成果。通過合理選擇目的基因、構建合適的表達載體以及運用有效的轉基因方法，成功實現了對菊花性狀的改良，包括抗蟲性增強、花色改變和花期調控等。然而，在轉基因技術的應用過程中，仍面臨著許多挑戰，如轉基因方法的優化、基因表達穩定性和安全性評估等。未來的研究需要進一步深入解決這些問題，以充分發揮轉基因技術在菊花遺傳改良中的潛力，推動菊花產業的可持續發展，同時保障生態環境和人類健康的安全。通過持續的努力，菊花轉基因研究將在自然與科技的融合之路上不斷前行，為花卉領域帶來更多的創新和驚喜。