基因治療作為一種新興的治療手段，在治療多種遺傳性和獲得性疾病方面展現出巨大的潛力。然而，基因傳遞過程中的關鍵問題之一是尋找安全、高效的載體系統。病毒載體雖然轉染效率高，但存在免疫原性和潛在的致瘤性等問題。因此，非病毒載體如納米材料受到了廣泛關注。
硅納米粒（SiNPs）由于其良好的穩定性、易于表面修飾和可調節的物理化學性質等優點，在生物醫學領域展現出良好的應用前景。多聚賴氨酸（PLL）是一種陽離子聚合物，具有良好的生物相容性和與核酸的結合能力。將 PLL 修飾到 SiNPs 表面有望提高納米粒與核酸的相互作用，并促進細胞攝取和轉染。本研究旨在制備多聚賴氨酸硅納米粒，并深入研究其在細胞轉染中的性能。
正硅酸四乙酯（TEOS）、氨水、多聚賴氨酸（PLL，不同分子量）、3 - (4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基)-2,5 - 二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、熒光標記的 DNA（F - DNA）、細胞培養基（DMEM、RPMI 1640 等）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、不同細胞系（如 HeLa、293T、MCF - 7 等）。
硅納米粒的合成
采用經典的 St?ber 法合成硅納米粒。在乙醇 - 水混合溶液中，將正硅酸四乙酯（TEOS）在氨水的催化作用下發生水解和縮聚反應。具體步驟如下：將一定量的乙醇、水和氨水混合均勻，然后逐滴加入 TEOS。反應在室溫下持續攪拌數小時后，通過離心收集納米粒，并用乙醇多次洗滌以去除雜質，得到純凈的硅納米粒。
多聚賴氨酸修飾硅納米粒
將合成的硅納米粒分散在適當的緩沖溶液（如磷酸鹽緩沖液，PBS）中。然后，將不同濃度的多聚賴氨酸溶液逐滴加入到納米粒分散液中，在溫和攪拌下反應一定時間。反應結束后，通過離心洗滌去除未結合的多聚賴氨酸，得到多聚賴氨酸硅納米粒（PLL - SiNPs）。通過改變 PLL 的濃度和反應時間等條件，優化修飾過程，以獲得最佳性能的納米粒。
粒徑和電位測定
使用動態光散射（DLS）儀器測定納米粒的粒徑大小和表面電位。將制備好的 PLL - SiNPs 分散在 PBS 中，測量其粒徑分布和平均粒徑，同時測量納米粒表面的 zeta 電位，以評估納米粒的穩定性和表面電荷性質。
形態觀察
通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察納米粒的形態。將納米粒分散液滴在銅網上，晾干后在 TEM 下觀察其形狀、大小和分散情況。
細胞培養
將不同的細胞系（如 HeLa、293T、MCF - 7 等）培養在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的相應培養基中，在 37°C、5% CO?的培養箱中培養。當細胞生長至合適密度時，進行后續實驗。
納米粒標記與攝取檢測
將 PLL - SiNPs 與熒光標記的 DNA（F - DNA）混合，孵育一段時間后，加入到培養的細胞中。在不同時間點（如 1、2、4、6 小時等），用 PBS 洗滌細胞，然后用胰蛋白酶消化收集細胞。通過流式細胞術（FCM）檢測細胞內的熒光強度，以評估納米粒的細胞攝取情況。同時，利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察納米粒在細胞內的分布情況。
轉染效率測定
將含有報告基因（如綠色熒光蛋白基因，GFP）的質粒 DNA 與 PLL - SiNPs 混合，形成納米粒 - DNA 復合物。將復合物加入到培養的細胞中，培養一定時間（24 - 48 小時）后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況，計算轉染效率。同時，采用流式細胞術進一步定量分析轉染效率。
轉染條件優化
通過改變納米粒與 DNA 的比例、轉染時間、轉染溫度等條件，優化轉染過程，以獲得最高的轉染效率。
MTT 法檢測細胞活力
將不同濃度的 PLL - SiNPs 加入到培養的細胞中，培養 24、48 和 72 小時后，加入 MTT 溶液。繼續培養 4 小時后，棄去培養液，加入 DMSO 溶解結晶物。在酶標儀上測定 570nm 處的吸光度值，計算細胞活力，評估納米粒的細胞毒性。
粒徑和電位
動態光散射結果顯示，合成的硅納米粒粒徑在一定范圍內（例如 100 - 200nm），表面電位為負。經過多聚賴氨酸修飾后，PLL - SiNPs 的粒徑略有增加，這可能是由于 PLL 的附著。同時，表面電位變為正，這有利于與帶負電的 DNA 相互作用。
形態觀察
透射電子顯微鏡圖像表明，硅納米粒呈球形，粒徑均勻，分散良好。多聚賴氨酸修飾后，納米粒的形態基本保持不變。
流式細胞術結果顯示，隨著時間的增加，細胞對 PLL - SiNPs - F - DNA 復合物的攝取量逐漸增加。共聚焦激光掃描顯微鏡圖像清晰地顯示了納米粒在細胞內的分布，主要分布在細胞質中，部分納米?？蛇M入細胞核周圍區域。不同細胞系對納米粒的攝取效率有所差異，這可能與細胞類型相關的膜受體和內吞機制有關。
轉染效率
熒光顯微鏡觀察和流式細胞術定量分析表明，PLL - SiNPs 在多種細胞系中均能實現基因轉染。在優化條件下，轉染效率可達到較高水平，例如在 HeLa 細胞中，轉染效率可達到 [X]%，與一些傳統的非病毒載體相比具有一定優勢。
轉染條件優化
研究發現，納米粒與 DNA 的比例對轉染效率有顯著影響。當比例為 [最佳比例] 時，轉染效率高。此外，轉染時間和溫度也對轉染效果有一定影響，適當延長轉染時間和在 37°C 下轉染有利于提高轉染效率。
MTT 法檢測結果表明，在一定濃度范圍內（如低于 [具體濃度]），PLL - SiNPs 對細胞活力沒有明顯影響，表明納米粒具有良好的生物相容性。然而，當納米粒濃度過高時，細胞活力會有所下降，提示在實際應用中需要注意納米粒的使用劑量。
本研究成功制備了多聚賴氨酸硅納米粒，并對其細胞攝取、轉染效率和生物相容性進行了詳細研究。多聚賴氨酸的修飾不僅改變了硅納米粒的表面電荷，有利于與 DNA 的結合，還促進了細胞對納米粒的攝取。細胞轉染實驗結果表明，PLL - SiNPs 作為一種非病毒載體具有較高的轉染效率，其性能可通過優化納米粒與 DNA 的比例、轉染時間和溫度等條件進一步提高。
生物相容性評價結果顯示，在合適的濃度范圍內，納米粒對細胞活力影響較小，這為其在生物醫學領域的應用提供了有利條件。然而，仍需要進一步深入研究納米粒在體內的分布、代謝和長期安全性等問題。此外，與其他先進的載體系統相比，PLL - SiNPs 的轉染效率還有進一步提升的空間，可以考慮結合其他功能分子或采用新型的制備策略來改進。
本研究制備的多聚賴氨酸硅納米粒具有良好的理化性質、較高的細胞攝取和轉染效率以及可接受的生物相容性。這些結果為其在基因治療和其他生物醫學領域的應用提供了有價值的數據支持。未來的研究將聚焦于進一步優化納米粒的性能和深入評估其體內安全性，以推動其向臨床應用的轉化。
