摘要：本研究旨在比較脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與電穿孔法在大鼠雪旺細胞中的轉(zhuǎn)染效率，并探討其應(yīng)用價值。實驗采用某品牌脂質(zhì)體和電穿孔設(shè)備，轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（GFP）質(zhì)粒。結(jié)果顯示，電穿孔法轉(zhuǎn)染效率顯著高于脂質(zhì)體法。此研究為神經(jīng)膠質(zhì)細胞基因治療提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

引言

神經(jīng)損傷疾病嚴重影響患者的生活質(zhì)量，探索有效的修復(fù)策略顯得尤為關(guān)鍵。許旺細胞（雪旺細胞）作為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的重要細胞，具有分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、引導(dǎo)軸突生長及髓鞘化的功能。然而，許旺細胞在體外培養(yǎng)及移植后存在增殖有限、易衰老等問題，限制了其臨床應(yīng)用。基因治療作為一種前沿手段，為解決這些問題提供了新的可能。

基因治療的核心在于高效、安全的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔法是兩種常用的基因轉(zhuǎn)染方法。脂質(zhì)體是由卵磷脂和神經(jīng)酰胺等制得的具有雙分子層結(jié)構(gòu)的人工膜，可與細胞膜融合，將藥物或基因送入細胞內(nèi)部。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作簡便，但轉(zhuǎn)染效率易受細胞類型、脂質(zhì)體組成及電荷性質(zhì)等因素影響。電穿孔法則是通過瞬間高壓電場促使細胞膜形成可逆微孔，便于外源基因進入細胞。相較于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，電穿孔法具有更高的轉(zhuǎn)染效率，但操作相對復(fù)雜，對細胞損傷較大。

構(gòu)建高效的許旺細胞基因轉(zhuǎn)染體系，不僅有助于深入了解許旺細胞的生物學(xué)特性，還能為神經(jīng)損傷修復(fù)提供新型細胞資源及理論支撐。本研究選取大鼠雪旺細胞為研究對象，比較脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與電穿孔法的轉(zhuǎn)染效率，以期為神經(jīng)膠質(zhì)細胞基因治療提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

材料與方法

1. 材料

• 細胞：大鼠雪旺細胞，分離自新生SD大鼠坐骨神經(jīng)，采用差速貼壁與酶消化法純化。

• 培養(yǎng)基：含特定生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)基。

• 脂質(zhì)體：某品牌脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。

• 質(zhì)粒：編碼綠色熒光蛋白（GFP）的真核表達質(zhì)粒。

• 設(shè)備：威尼德電穿孔設(shè)備。

2. 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將純化后的大鼠雪旺細胞置于含特定生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37°C、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液、傳代，確保細胞狀態(tài)良好，用于后續(xù)實驗。

2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

按照某品牌脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，將編碼GFP的真核表達質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合后，加入大鼠雪旺細胞中，孵育一定時間后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)染效率。

2.3 電穿孔法

將大鼠雪旺細胞與編碼GFP的真核表達質(zhì)粒混合后，置于某品牌電穿孔設(shè)備的樣品槽中，設(shè)置不同電壓梯度（如100-300 V）與脈沖時長組合（10-50 ms），進行電穿孔處理。處理后，將細胞置于新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)染效率。

2.4 轉(zhuǎn)染效率檢測

采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細胞的綠色熒光強度，計算熒光陽性細胞占總細胞數(shù)的比例，以此評價轉(zhuǎn)染效率。同時，采用實時定量PCR測定GFP mRNA量，進一步驗證轉(zhuǎn)染效率。

實驗結(jié)果

1. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法結(jié)果

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒至大鼠雪旺細胞的效率為（15.6±2.3）%。熒光顯微鏡下觀察，可見部分細胞發(fā)出綠色熒光，但熒光強度較弱，熒光陽性細胞比例較低。實時定量PCR結(jié)果顯示，GFP mRNA表達量相對較低。

2. 電穿孔法結(jié)果

采用電穿孔法轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的效率高達（40.6±3.3）%。熒光顯微鏡下觀察，可見大量細胞發(fā)出強烈綠色熒光，熒光陽性細胞比例顯著提高。實時定量PCR結(jié)果顯示，GFP mRNA表達量顯著高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。

討論

本研究比較了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與電穿孔法在大鼠雪旺細胞中的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，電穿孔法的轉(zhuǎn)染效率顯著高于脂質(zhì)體法。這可能與電穿孔法通過瞬間高壓電場促使細胞膜形成可逆微孔，便于外源基因進入細胞有關(guān)。此外，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法易受細胞類型、脂質(zhì)體組成及電荷性質(zhì)等因素影響，而電穿孔法則相對不受這些因素影響，具有更廣泛的適用性。

電穿孔法雖然轉(zhuǎn)染效率高，但對細胞損傷較大。本研究通過設(shè)置不同電壓梯度與脈沖時長組合，篩選出了合適電穿孔參數(shù)（電壓200 V，脈沖時長30 ms），在此參數(shù)下，細胞膜微孔形成適度，既能保障質(zhì)粒順利進入，又一定程度減少對細胞的損傷。這為其他類似細胞基因轉(zhuǎn)染提供了借鑒。

許旺細胞在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中扮演關(guān)鍵角色，但其增殖有限、易衰老等問題限制了其臨床應(yīng)用。本研究通過構(gòu)建高效的許旺細胞基因轉(zhuǎn)染體系，為許旺細胞基因治療提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。未來，可將編碼具有促進增殖、抗衰老功能的基因?qū)朐S旺細胞，以增強其修復(fù)效能。

創(chuàng)新與應(yīng)用前景

1. 創(chuàng)新點

• 本研究比較了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與電穿孔法在大鼠雪旺細胞中的轉(zhuǎn)染效率，并篩選出了合適電穿孔參數(shù)。

• 本研究為許旺細胞基因治療提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，具有創(chuàng)新性。

2. 應(yīng)用前景

• 本研究構(gòu)建的許旺細胞基因轉(zhuǎn)染體系可用于神經(jīng)損傷修復(fù)的研究，為神經(jīng)損傷疾病的治療提供新型細胞資源。

• 通過導(dǎo)入具有促進增殖、抗衰老功能的基因，可增強許旺細胞的修復(fù)效能，提高其臨床應(yīng)用價值。

• 本研究的方法和技術(shù)可推廣至其他類似細胞的基因轉(zhuǎn)染研究，為基因治療領(lǐng)域提供新的思路和技術(shù)手段。

結(jié)論

本研究比較了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與電穿孔法在大鼠雪旺細胞中的轉(zhuǎn)染效率，并篩選出了合適電穿孔參數(shù)。結(jié)果顯示，電穿孔法的轉(zhuǎn)染效率顯著高于脂質(zhì)體法。本研究構(gòu)建的許旺細胞基因轉(zhuǎn)染體系為神經(jīng)損傷修復(fù)的研究提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，具有廣闊的應(yīng)用前景。未來，可進一步探索許旺細胞基因治療在神經(jīng)損傷疾病中的應(yīng)用，為患者帶來福音。