摘要：

本研究旨在利用畢赤酵母表達(dá)體系高效純化人胰島新生相關(guān)蛋白（INGAP），以探索其在胰島再生和糖尿病治療中的潛在應(yīng)用。通過構(gòu)建INGAP基因的畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系，優(yōu)化表達(dá)條件，并采用親和層析等方法純化目標(biāo)蛋白。結(jié)果顯示，畢赤酵母體系能高效表達(dá)并純化INGAP，為糖尿病治療提供新思路。

引言：

胰島新生相關(guān)蛋白（Islet Neogenesis Associated Protein，INGAP）是一種具有促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞向胰島分化和再生的蛋白質(zhì)，其在胰島再生和糖尿病治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。INGAP的發(fā)現(xiàn)和研究為糖尿病的治療提供了新的方向，尤其是在胰島移植和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。然而，INGAP的獲取和純化一直是制約其研究和應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

傳統(tǒng)的INGAP獲取方法主要依賴于從天然組織中提取，這種方法不僅效率低下，而且難以獲得高純度的INGAP。因此，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建INGAP的高效表達(dá)體系，并實(shí)現(xiàn)其純化，對(duì)于推動(dòng)INGAP的研究和應(yīng)用具有重要意義。

畢赤酵母（Pichia pastoris）作為一種常用的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有高效、穩(wěn)定、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)和純化。畢赤酵母表達(dá)體系能夠完成復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊和修飾過程，如糖基化、剪切和磷酸化等，從而確保目標(biāo)蛋白的生物活性和功能。

本研究旨在利用畢赤酵母表達(dá)體系高效純化INGAP，通過構(gòu)建INGAP基因的畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系，優(yōu)化表達(dá)條件，并采用親和層析等方法純化目標(biāo)蛋白。期望通過本研究，為INGAP的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供有力的技術(shù)支持，為糖尿病治療提供新的思路和方法。

一、材料與方法

1. 材料

• 菌株與載體：畢赤酵母GS115菌株，INGAP基因表達(dá)載體pPIC9K（含AOX1啟動(dòng)子和α-factor信號(hào)肽序列）。

• 試劑：某試劑公司的YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、甲醇、SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂、G25凝膠過濾柱等。

• 儀器設(shè)備：某品牌電泳儀、某品牌離心機(jī)、某品牌振蕩培養(yǎng)箱、某品牌分光光度計(jì)、威尼德電穿孔儀等。

2. 方法

2.1 畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建

• 將INGAP基因插入到表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建INGAP-pPIC9K重組質(zhì)粒。

• 采用電穿孔法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母GS115菌株中，篩選高拷貝陽性克隆。

2.2 表達(dá)條件的優(yōu)化

• 將陽性克隆接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

• 轉(zhuǎn)入BMGY培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600達(dá)到3-6。

• 離心收集菌體，用無菌水洗滌后，重懸于BMMY培養(yǎng)基中，加入甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。

• 每隔24小時(shí)補(bǔ)加甲醇，持續(xù)誘導(dǎo)4天。

2.3 蛋白質(zhì)的純化

• 離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵液上清。

• 采用SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂進(jìn)行初步純化。

• 收集目的峰后，用G25凝膠過濾柱進(jìn)行進(jìn)一步純化。

• 將純化后的INGAP進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western Blot鑒定。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建

成功構(gòu)建了INGAP-pPIC9K重組質(zhì)粒，并通過電穿孔法將其導(dǎo)入畢赤酵母GS115菌株中。經(jīng)過篩選，獲得了高拷貝陽性克隆。

2. 表達(dá)條件的優(yōu)化

在優(yōu)化的表達(dá)條件下，畢赤酵母能夠高效表達(dá)INGAP。通過甲醇誘導(dǎo)4天后，發(fā)酵液上清中的INGAP濃度達(dá)到較高水平。

3. 蛋白質(zhì)的純化

經(jīng)過SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂和G25凝膠過濾柱的純化，獲得了高純度的INGAP。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，純化后的INGAP分子量與預(yù)期相符，且純度較高。Western Blot鑒定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了純化產(chǎn)物的特異性。

三、討論

1. 畢赤酵母表達(dá)體系的優(yōu)勢(shì)

畢赤酵母表達(dá)體系具有高效、穩(wěn)定、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，能夠完成復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊和修飾過程，從而確保目標(biāo)蛋白的生物活性和功能。在本研究中，畢赤酵母成功表達(dá)了INGAP，并實(shí)現(xiàn)了其高效純化，為INGAP的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持。

2. 純化方法的優(yōu)化

在純化過程中，采用了SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂和G25凝膠過濾柱的組合純化方法。這種方法不僅能夠有效去除雜質(zhì)，提高INGAP的純度，還能夠保持INGAP的生物活性。通過優(yōu)化純化條件，獲得了高純度的INGAP，為后續(xù)研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。

3. INGAP的應(yīng)用前景

INGAP作為一種具有促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞向胰島分化和再生能力的蛋白質(zhì)，在胰島再生和糖尿病治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。通過畢赤酵母表達(dá)體系純化INGAP，為糖尿病治療提供了新的思路和方法。未來，可以進(jìn)一步探索INGAP在胰島移植、胰島再生以及糖尿病治療中的應(yīng)用，為糖尿病患者帶來更好的治療效果和生活質(zhì)量。

4. 研究的創(chuàng)新點(diǎn)

本研究利用畢赤酵母表達(dá)體系高效純化了INGAP，并優(yōu)化了表達(dá)條件和純化方法。通過這種方法，可以獲得高純度、活性穩(wěn)定的INGAP，為INGAP的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持。此外，本研究還探索了INGAP在糖尿病治療中的潛在應(yīng)用，為糖尿病治療提供了新的思路和方法。