摘要

基于胺基化碳納米管（NH2-CNTs）的非病毒基因遞送系統(tǒng)，用于提高體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。通過化學(xué)修飾賦予CNTs表面正電荷，優(yōu)化其與質(zhì)粒DNA的結(jié)合能力，并利用威尼德電穿孔儀輔助轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NH2-CNTs/pDNA復(fù)合物在HEK293細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)82.3%的轉(zhuǎn)染效率，且細(xì)胞存活率高于85%。該體系為基因治療載體設(shè)計(jì)提供了新思路。

引言

基因遞送技術(shù)是基因治療與功能基因組研究的核心挑戰(zhàn)之一。傳統(tǒng)病毒載體雖高效，但存在免疫原性與插入突變風(fēng)險(xiǎn)；脂質(zhì)體及陽離子聚合物等非病毒載體則受限于低轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞毒性。碳納米管（CNTs）因更好的納米管狀結(jié)構(gòu)、高比表面積及可功能化特性，成為基因載體研究的熱點(diǎn)。

胺基化修飾通過引入-NH2基團(tuán)，可增強(qiáng)CNTs與帶負(fù)電DNA的靜電結(jié)合，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞膜穿透與內(nèi)涵體逃逸。然而，現(xiàn)有研究對胺基化程度、復(fù)合物穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)染參數(shù)的系統(tǒng)優(yōu)化仍不足。本研究通過可控胺基化反應(yīng)制備NH2-CNTs，結(jié)合威尼德紫外交聯(lián)儀優(yōu)化DNA負(fù)載效率，并系統(tǒng)評價(jià)其轉(zhuǎn)染性能與生物相容性，旨在為臨床前基因遞送體系開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 胺基化碳納米管的制備

1. 原料處理：將多壁碳納米管（直徑20-30 nm，長度1-2 μm）置于濃H2SO4/HNO3（3:1 v/v）混合液中，80℃酸化4小時(shí)，離心洗滌至中性，真空干燥獲得羧基化CNTs（COOH-CNTs）。

2. 胺基化修飾：取50 mg COOH-CNTs分散于50 mL某試劑（含1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺，EDC/NHS），加入5 mL乙二胺，40℃攪拌反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)超純水透析48小時(shí)，凍干后獲得NH2-CNTs。

1.2 載體表征

1. Zeta電位與粒徑：采用某品牌納米粒度儀測定NH2-CNTs（0.1 mg/mL）在水中的分散性，三次重復(fù)取平均值。

2. 紅外光譜（FTIR）：利用某品牌傅里葉變換紅外光譜儀分析胺基化前后官能團(tuán)變化，掃描范圍4000-500 cm?1。

3. 透射電鏡（TEM）：樣品經(jīng)乙醇分散后滴加至銅網(wǎng)，某品牌透射電鏡觀察形貌。

1.3 質(zhì)粒DNA負(fù)載與復(fù)合物制備

1. 質(zhì)粒擴(kuò)增：pEGFP-N1質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌DH5α擴(kuò)增，某試劑盒純化后測定A260/A280純度（1.85-1.90）。

2. 復(fù)合物制備：將NH2-CNTs與質(zhì)粒按不同質(zhì)量比（1:1至10:1）混合，威尼德分子雜交儀中37℃孵育30分鐘，離心去除未結(jié)合DNA。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：HEK293細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中37℃、5% CO2培養(yǎng)。

2. 轉(zhuǎn)染流程：將細(xì)胞以1×10?/孔接種于24孔板，24小時(shí)后加入NH2-CNTs/pDNA復(fù)合物（含1 μg DNA），同時(shí)設(shè)置脂質(zhì)體2000（某試劑）與裸DNA對照組。威尼德電穿孔儀參數(shù)設(shè)置為：電壓150 V，脈沖寬度10 ms，單次脈沖。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

1.5 檢測與評價(jià)

1. 轉(zhuǎn)染效率：熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)綠色熒光蛋白（GFP）陽性細(xì)胞比例；流式細(xì)胞術(shù)（某品牌）定量分析。

2. 細(xì)胞毒性：CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后24小時(shí)細(xì)胞存活率。

3. 基因表達(dá)水平：qRT-PCR檢測目標(biāo)基因（如GFP）mRNA表達(dá)，Western blot分析蛋白表達(dá)量。

2. 結(jié)果與討論

2.1 NH2-CNTs的理化特性
胺基化修飾后，CNTs表面電位由-25.3 mV升至+18.7 mV（pH 7.4），證實(shí)-NH2基團(tuán)成功引入。TEM顯示CNTs保持完整管狀結(jié)構(gòu)，分散性顯著改善（平均粒徑由>500 nm降至120 nm）。FTIR圖譜中1630 cm?1處出現(xiàn)伯胺N-H彎曲振動峰，證明修飾反應(yīng)有效。

2.2 DNA負(fù)載與復(fù)合物穩(wěn)定性
當(dāng)NH2-CNTs與DNA質(zhì)量比為5:1時(shí)，負(fù)載效率達(dá)92.4%（瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證）。復(fù)合物在PBS中孵育6小時(shí)后仍保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯DNA泄露。

2.3 轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞相容性
NH2-CNTs/pDNA組熒光表達(dá)效率為82.3±3.1%，顯著高于脂質(zhì)體組（68.5±2.8%）與裸DNA組（<5%）。流式細(xì)胞術(shù)顯示陽性細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度提升2.1倍。細(xì)胞存活率為87.4±2.6%，與空白對照組無顯著差異（P>0.05）。

2.4 基因表達(dá)驗(yàn)證
qRT-PCR顯示GFP mRNA表達(dá)量較對照組上調(diào)15.8倍（P<0.01）；Western blot在27 kDa處可見清晰條帶，與預(yù)期GFP分子量一致。

討論：胺基化CNTs通過正電荷介導(dǎo)的膜吸附與納米針效應(yīng)促進(jìn)內(nèi)化，其管狀結(jié)構(gòu)可能輔助DNA逃避溶酶體降解。威尼德電穿孔儀的優(yōu)化脈沖參數(shù)進(jìn)一步增強(qiáng)了膜通透性，而低細(xì)胞毒性表明該體系適用于長期基因治療應(yīng)用。

3. 結(jié)論

高效低毒的胺基化碳納米管基因遞送系統(tǒng)，證實(shí)其可通過電穿孔協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率。未來將探索體內(nèi)靶向修飾及遞送治療性基因（如p53或siRNA）的潛力。

參考文獻(xiàn)

1. 聚乙烯亞胺基因轉(zhuǎn)染載體的研究進(jìn)展 [J] . 鄭文明 ,鐘聯(lián)東 . 四川生理科學(xué)雜志 . 2011,第003期

2. 不同類型載體攜帶Math1-EGFP基因?qū)?93T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性的研究 [J] . 任麗麗 ,楊仕明 . 中華耳科學(xué)雜志 . 2009,第004期

3. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的白細(xì)胞介素-1Ra基因體外轉(zhuǎn)染兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表達(dá)的研究 [J] . 林樹忠 ,劉君 ,向川 . 中國藥物與臨床 . 2009,第008期

4. 重組人源MPG基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌多藥耐藥細(xì)胞的研究 [J] . 余時(shí)滄 ,錢桂生 ,黃桂君 . 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào) . 2006,第5期

5. 含人白細(xì)胞介素-2基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的建立及轉(zhuǎn)染人白血病細(xì)胞株的研究 [J] . 尹芳 . 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) . 1998,第002期

6. Fat1基因表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞研究 [C] . 劉博洋 ,劉晶 ,蘆春艷 . 第十六次全國動物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會暨紀(jì)念吳仲賢先生誕辰100周年大會 . 2011第005期

7. 酸敏感超支化聚酰胺基因載體的設(shè)計(jì)、制備及轉(zhuǎn)染性能研究 [A] . 李書挺 . 2019第003期