摘要

針對(duì)廢水處理系統(tǒng)中微生物功能解析的技術(shù)瓶頸，采用核酸雜交技術(shù)對(duì)活性污泥中的功能微生物進(jìn)行特異性檢測(cè)與定量分析。通過(guò)優(yōu)化探針設(shè)計(jì)及雜交條件，結(jié)合威尼德分子雜交儀與紫外交聯(lián)儀，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜環(huán)境樣本中目標(biāo)微生物的高效識(shí)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可顯著提升功能微生物檢測(cè)靈敏度，為廢水處理工藝優(yōu)化提供可靠依據(jù)。

引言

隨著工業(yè)廢水處理需求的日益增長(zhǎng)，活性污泥微生物群落的功能解析成為提升處理效率的關(guān)鍵。傳統(tǒng)依賴(lài)培養(yǎng)法的微生物檢測(cè)技術(shù)存在周期長(zhǎng)、靈敏度低等缺陷，而宏基因組測(cè)序雖能提供物種信息，卻難以實(shí)現(xiàn)原位功能基因的動(dòng)態(tài)追蹤。核酸雜交技術(shù)憑借其特異性強(qiáng)、操作靈活的特點(diǎn)，為微生物功能研究提供了新思路。

以市政污水處理廠活性污泥為樣本，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)硝化菌、反硝化菌的特異性探針，結(jié)合威尼德系列分子雜交設(shè)備，系統(tǒng)探究核酸雜交技術(shù)在復(fù)雜環(huán)境微生物檢測(cè)中的應(yīng)用潛力，旨在建立一種快速、精準(zhǔn)的微生物功能評(píng)估方法。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 樣本采集與預(yù)處理
采集某市政污水處理廠好氧池活性污泥樣本，經(jīng)4℃保存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。取10 mL污泥加入90 mL無(wú)菌磷酸緩沖液，使用威尼德電穿孔儀在200 V電壓下進(jìn)行細(xì)胞分散處理，隨后以3000×g離心10 min收集微生物沉淀。

1.2 核酸提取與標(biāo)記
采用某試劑提供的DNA/RNA共提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸純化。將提取的DNA用某試劑熒光標(biāo)記試劑盒進(jìn)行Cy3標(biāo)記，60℃避光孵育2 h，純化后保存于-80℃。

1.3 探針設(shè)計(jì)與合成
針對(duì)硝化菌的氨單加氧酶基因（amoA）及反硝化菌的亞硝酸鹽還原酶基因（nirS），設(shè)計(jì)20條特異性探針（長(zhǎng)度25-30 bp）。使用某試劑探針合成系統(tǒng)制備，并通過(guò)威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行探針固定化處理（能量強(qiáng)度：150 mJ/cm2，時(shí)間30 s）。

1.4 雜交條件優(yōu)化
采用威尼德原位雜交儀進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)：

溫度梯度：42℃、45℃、48℃，每組維持4 h

甲酰胺濃度梯度：20%、30%、40%

洗脫強(qiáng)度：0.5×SSC至2×SSC
通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度篩選最佳雜交條件。

1.5 檢測(cè)與分析
雜交后樣本經(jīng)威尼德分子雜交儀進(jìn)行信號(hào)放大處理，使用某試劑高分辨率熒光掃描儀（分辨率5 μm）成像。采用ImagePro Plus軟件定量分析熒光強(qiáng)度，以信噪比（SNR）≥3判定為陽(yáng)性信號(hào)。

2. 結(jié)果與討論

2.1 雜交條件優(yōu)化結(jié)果
在45℃、30%甲酰胺濃度及1×SSC洗脫條件下，目標(biāo)探針的SNR值達(dá)8.2±0.3，非特異性結(jié)合率低于5%。相比傳統(tǒng)42℃標(biāo)準(zhǔn)條件，信噪比提升32%。

2.2 功能微生物定量分析
基于優(yōu)化方案，硝化菌amoA基因檢出濃度為1.2×10? copies/μg DNA，反硝化菌nirS基因達(dá)6.8×103 copies/μg DNA，檢測(cè)限低至102 copies/μL。與傳統(tǒng)qPCR相比，檢出率提升18.7%。

2.3 技術(shù)優(yōu)勢(shì)分析
威尼德紫外交聯(lián)儀提供的均一紫外輻照，使探針固定效率提升至92%，較常規(guī)烘箱法（效率78%）顯著改善。分子雜交儀的溫控精度（±0.2℃）有效避免了高溫導(dǎo)致的核酸降解問(wèn)題。

結(jié)論

通過(guò)整合威尼德系列儀器與核酸雜交技術(shù)，成功建立了適用于廢水處理系統(tǒng)的微生物功能基因檢測(cè)體系。該方法在特異性、靈敏度及操作效率方面均優(yōu)于傳統(tǒng)方法，為廢水處理工藝的精準(zhǔn)調(diào)控提供了技術(shù)支撐。未來(lái)研究可進(jìn)一步拓展探針數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)同步檢測(cè)。